Coqueluche es una enfermedad causada principalmente por Bordetella pertussis en la edad pediátrica. Los criterios clínicos diagnósticos deben confirmarse por cultivo, serología o por PCR. Nuestro objetivo fue desarrollar y validar clínicamente tres métodos de PCR que permitan diagnosticar, determinar prevalencia, y evaluar la eficacia vacunal contra Pertussis. Se estudiaron 285 muestras de aspirados nasofaringeos (ANF) provenientes de pacientes pediátricos sintomáticos, que presentaron episodios de tos. Se incluyeron 84 muestras de hisopados nasofaríngeos (HNF) correspondientes a contactos cercanos de los pacientes. Las regiones del genoma utilizadas para el diagnóstico por PCR de B. pertussis fueron la promotora del gen de la toxina Pertussis, IS481 y el gen de la Flagelina, este ultimo para diferenciar B. pertussis de B. parapertussis y bronchiseptica. El limite de detección para B. pertussis fue de 75 ufc, 1,5 ufc y 1,5x104 ufc respectivamente, para B. parapertussis y B. bronchiseptica fue de 50 ufc. El 29 por ciento de las muestras analizadas dieron reacción positiva por PCR para B. pertussis (108/369) y correspondieron a 98 niños y 10 contactos, de estos últimos, 5 cursaban en forma asintomática y 5 presentaban tos leve. La mayor incidencia se observó entre Abril y Junio afectando principalmente niños menores de 2 meses (38/82=46 por ciento), en el resto de los grupos separados por numero de dosis vacunal recibida fue menor del 37 por ciento disminuyendo al aumentar la dosis. Todas las muestras dieron negativas para B. parapertussis y B. bronchiseptica. 124 pacientes cumplían con los criterios clínicos de diagnóstico según Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) confirmándose por PCR 67 (54 por ciento). De los 245 restantes 41 (17 por ciento) fueron positivos. Concluimos que los métodos de PCR para el gen de la toxina Pertussis y IS481 son altamente sensibles, específicos y rápidos como para confirmar el diagnóstico, incluso cuando la clínica no es marcada. En niños, se observa una gran incidencia en pacientes que no recibieron vacuna. Los contactos son potenciales portadores y diseminadores de la enfermedad que pueden incluso cursar en forma asintomática por lo que es importante su diagnostico temprano y se deberían incluir en el diagnostico microbiológico para instaurar la quimioprofilaxis adecuada y evitar posibles brotes epidémicos.